با پیدایش تکنولوژی ویرایش ژنوم با استفاده از نوکلئازهای هدف‌یاب و اختصاصی مثل ZFNS، TALENS و پروتئین‌های Cas بسیاری از جنبه‌های علوم زیستی دچار تحول شده است. دو بازیگر اصلی در این تکنولوژی، نوکلئاز هدف‌یاب (که در جایگاه دلخواه روی ژنوم DSB ایجاد می‌کند) و مکانیسم‌های سلولی ترمیم شکاف در دو رشته‌ی DNA یا DSB (Double strand break) هستند. عمدتا DSBها از طریق دو مسیر ترمیم می‌شوند یکی Non-homologues end joining (NHEJ) و دیگری Homology directed repair (HDR) است. NHEJ در برخی موارد دچار اشتباه میشود، در حالیکه HDR نسبت به NHEJ دقیق‌تر عمل می‌کند و برای ترمیم نیاز به DNAی الگو دارد. بنابراین ایجاد یک DSB مشخص در یک جایگاه مشخص روی ژنوم با استفاده از نوکلئازهای هدف‌یاب می‌تواند موجب ایجاد موتاسیون در آن جایگاه شود. به علاوه وارد کردن هم زمان نوکلئازهای هدف‌یاب و وکتور دهنده (Donor vector) می‌تواند HDR را افزایش داده و باعث افزایش اینتگره شدن (Knock in) ترنسژن شود. لازم به ذکر است که وکتوردهنده شامل توالی‌های شبیه اطراف ناحیه DSB (بازوهای چپ و راست مشابه (Homologues arms) می‌باشد. تا به امروز با استفاده از این تکنولوژی، توالی‌های ژنومی تعداد زیادی از ارگانیسم‌های مدل دستکاری و ویرایش شده است. این مدل‌ها شامل سلول‌های کشت داده شده‌ی انسانی مثل سلول‌های بنیادی جنینی (ES) و یا (iPSC)، نماتودها، کرم ابریشم‌ها، توتیای دریایی، نرم تنان، ماهی‌ها، دوزیستان، موش‌ها، رت‌ها و گیاهان می‌باشند. اگرچه مشکلات تکنیکی طراحی ZFNها، گسترش ویرایش ژنوم با استفاده از این نوکلئازها را متوقف ساخت، با این وجود بعد از سال 1996 پایه و اساس تکنولوژی ویرایش ژنوم با مطالعه بر روی این آنزیم‌ها شکل گرفت. بعد از پیدایش TALENها در سال 2010 و سیستم CRISPR/Cas در سال 2013، ویرایش ژنوم با استفاده از ایجاد DSB در جایگاه مورد نظر، بسیار گسترش یافته است. قابل ذکر است که در حال حاضر ما در دوره‌ی ویرایش ژنوم هستیم.
امروزه اندونوکلئازهای راهنمایی شونده توسط RNA (RGENها) که به عنوان CRISPR/Cas9 شناخته می‌شوند، تحقیقات مهندسی ژنوم را دچار تحول بزرگی کرده‌اند. به دلیل سادگی CRISPR/Cas9 نسبت به ZFNها و TALENها، این تکنولوژی خیلی سریع و در طول یک دوره‌ی زمانی کوتاه به عنوان روش استاندارد دستکاری ژنها معرفی شده است. به احتمال زیاد در سال‌های پیشرو، استراتژی‌های ویرایش ژنوم به واسطه‌ی CRISPR/Cas9 وارد زمینه‌ی ژنومیک عملکردی (Functional genomics) شوند. علاوه بر این، به کارگیری Cas9 غیر فعال شده (dcas9) متصل به دمین‌های عملکردی مختلف، پتانسیل این روش را افزایش خواهد داد. CRISPR/Cas9 نه تنها چهره‌ی مهندسی ژنتیک را تغییر داده است بلکه زمینه‌های تحقیقات در علوم زیستی را نیز دچار تحول شگرفی ساخته است. ویرایش ژنوم با استفاده از ZFNها و TALENها ( به صورت In vivo) بسیار شبیه به دستکاری‌های DNA با استفاده از آنزیم‌های محدودگر است. پیشرفت‌های اخیر در زمینه‌ی مهندسی نوکلئازهای برنامه‌ریزی شونده، محدودیت‌های روش TALEN را از میان برداشته است و منجر به استفاده از این آنزیم شبیه به آنزیم محدودگر در زمینه‌ی مهندسی شده است. از طرف دیگر استراتژی‌های ویرایش ژنومی به واسطه‌ی نوکلئازهای مهندسی شده نیاز به ساخت نوکلئازهای از پیش طراحی شده بر طبق توالی DNAی ژنومی مورد نظر دارد.
لوکوس CRISPR در ژنوم برخی از باکتری‌ها و آرکی باکترها دیده میشود. این لوکوس حاوی تکرارهای پشت سرهم فاصله انداز (Spacer) است که تکرارها حاوی توالی‌های یکسان و فاصله اندازها حاوی توالی‌های متفاوت مشتق شده از توالی DNAی خارجی (مثلا DNAی باکتریوفاژی) می‌باشند. لوکوس CRISPR به همراه پروتئین‌های مربوط به CRISPR (Cas) به عنوان سیستم ایمنی اکتسابی بر علیه DNAی خارجی عمل می‌کنند. در چنین سیستمی ابتدا DNAی خارجی در ناحیه‌ی فاصله انداز در ژنوم باکتری در لوکوس CRISPR وارد شده و سپس به شکل یک پیش‌ساز (Pre-crRNA) طویل رونویسی میشود. این Pre-crRNA حاوی چندین تکرار و فاصله اندازها می‌باشد. در مرحله‌ی بعد Pre-crRNA (در سیستم نوع 2) به دو مولکول تبدیل میشود. مولکول اول crRNAی حاوی یک فاصله انداز مکمل با یک DNAی خارجی است. در حالیکه مولکول دوم RNAی کوچکی به نام trans crRNA (tracrRNA) است. در نهایت هتروکمپلکس crRNA-tracrRNA به عنوان یک مولکول راهنما (gRNA) برای هدف قرار دادن DNAی خارجی و ایجاد DSB به همراه پروتئین‌های Cas عمل می‌کنند.
وقتی از سیستم CRISPR/Cas9 به منظور ویرایش ژنوم استفاده میشود دو جز مورد نیاز است. اولی یک RNAی راهنمایی (gRNA) کایمر که شبیه کمپلکس crRNA-tracrRNA عمل می‌کند و دیگری یک پروتئین Cas9 که فعالیت نوکلئازی دارد. اگرچه اختصاصیت هدف قرار دادن ژنوم به طور عمده به توالی gRNA بستگی دارد اما Cas9 نیز به یک توالی به نام موتیف مجاور پیش فاصله اندازه (PAM) نیاز دارد. توالی PAM در بین گونه‌های مختلف موجودات متفاوت است. برای مثال پروتئین Cas9 باکتری استرپتوکوک پیوژنز (SpCas9) به NGG نیازدارد و باکتری استرپتوکوک ترموفیلوس (StCas9) به توالی NNAGAAW نیاز دارد. در حال حاضر SpCas9 بیشتر از تمامی Casهای دیگر در مهندسی ژنتیک استفاده میشود. مکانیسم عملکرد به گونه‌ای است که ابتدا کمپلکس SpCas9 – gRNA توالی PAM را بر روی ژنوم جستجو می‌کند. سپس این کمپلکس دو رشته‌ی DNAی را از هم باز می‌کند تا RNA با DNA هدف جفت شود. سپس یک DSB در ناحیه‌ی بین بازهای 3 و 4 بالادست توالی PAM ایجاد میشود. شکست DNA از طریق 2 دمین نوکلئاز Cas9 (دمین HNH و دمین RuvC) انجام میشود. هر کدام از این دو دمین یک شکاف (Nick) در روبروی هم ایجاد می‌کند که منجر به ایجاد DSB میشود.